BBB实验经久不衰，但在实际的操作却很容易出现渗漏，来看看下面的构建的步骤吧，全干货分享，点个关注，科研之途不迷路

细胞选择：HPBC(人脑血管周细胞,启达生物,货号：CD5022）HBMEC(人脑微血管内皮细胞,启达生物，货号：CD5177）

培养基选择：PGM(周细胞培养基,启达生物，货号：P4001）ECGM(内皮细胞培养基,启达生物，货号：P1001）

1. 为了让原代细胞能传更多的代次，我们可以感染hTERT病毒让细胞进行永生化改造 ，根据实践永生化后的细胞可传40多代，可能SV40病毒更便宜，但是SV40感染后的细胞大部分都需要在33°增殖，而hTERT在37°就能适应。

2. 感染后的细胞需要加入Blasticidin S HCl筛选，为了保持细胞的永生化，感染后需要一直加入终浓度（f.c.）4µg/ml培养，以维持细胞更多倍增。

细胞处理好了 ，现在就开始我们的BBB实验吧：

1. 准备24孔transwell培养板，准备好ECGM内皮细胞培养基，细胞包被液，在室温中预热。
2. 在超净台中拆开培养板，使用200ul包被液或者稀释好的胶原酶进行培养前的细胞板包被。
3. 包被完成后，使用枪头将包被液吸出，在每个孔中加入200ul的ECGM内皮细胞培养基，并将培养板放入培养箱中预热。
4. 对实验的细胞，将其从培养箱中取出，吸出培养基，以T75为例用10mL DPBS洗涤，去除DPBS，并加入4 mL 0.05%胰蛋白酶，常温消化3-5分钟后显微镜下观察，细胞变得椭圆透亮后轻拍细胞瓶，细胞脱落，立即加入双倍胰酶的含血清的完全培养基终止消化，并1000转5分钟收集细胞。
5. 用10μL台盼蓝染色制备三个0.5mL的试管，并用细胞名称标记细胞计数室载玻片。
6. 用移液管从HBMEC或者HPBC细胞悬浮液中吸取10μL，并在0.5mL试管中与10μL台盼蓝染色混合。用移液管将10μL台盼蓝染色的细胞悬浮液移到标记细胞计数室载玻片的两侧。
7. 将HBMEC和HPBC混合按照1：1混合后（500μL，密度为1.6×105个细胞/mL）接种在细胞培养孔中的半透膜（Transwell插入物）上，形成两个明确的隔室：顶部或上部隔室，可被视为“血液侧”，基底外侧或下部隔室，被视为”大脑侧“，融合的细胞的单层代表血脑屏障，为了方便后期的检测，在进行细胞定位分析时，两种细胞细胞可以与适当的物质混合[例如，CellTracker橙色CMTMR染料（541/565 nm）、红色荧光染料。
8. 隔天换液，细胞生长4天或达到100%融合，检测连接复合物形成和受限的渗透性。

人脑微血管内皮细胞（HBMEC)

小细节多注意：
1. 在孔中抽吸试剂的时候，请不要触摸微孔
2. 避免在低细胞密度水平下培养（应始终将融合率保持在50%以上）
3. 换液需谨慎，以防止细胞漂浮或细胞特征的丧失
4. 应始终向每种培养基中添加Blasticin S（f.c.4µg/mL），以保持永生化基因的表达。

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